بیماری کم خونی عفونی بیماری است ویروسی با عامل CIAV که علاوه بر ایجاد مرگ و میر موجب آنمی ناشی از تحلیل بافت های خونساز و مغز استخوان و تضعیف سیستم ایمنی، و این بیماری خسارات اقتصادی فراوانی را ناشی از مرگ و میر، رشد کم و نامنظم، افزایش مصرف آنتی بیوتیک و عدم کنترل دیگر بیماری های عفونی در پی خواهد داشت.با توجه به اینکه انتشار این ویروس و این بیماری جهانی است و در ایران نیز وجود دارد و تحقیق مناسبی در این زمینه در سطح شهرستان گرمسار  صورت نگرفته بود بنابراین با توجه به مطالب ذکر شده در بالا در این تحقیق به  ردیابی موارد عفونت با ویروس CIAV در سطح گله های گوشتی گرمسار پرداخته شد. از 20 گله ی طیور واقع در شهرستان گرمسار در بین سن 4-2 هفتگی به صورت رندم از کبد و طحال نمونخ اخذ شد نمونه ها بلافاصله به آزمایشگاه انتقال یافتند تا به لحاظ حضور ویروس کم خونی عفونی مورد بررسی قرار گیرد سپس نمونه ها با کیت تجاری استخراج DNA شد و توسط پرایمر های اختصاصی ژن CIAV  جهت جستجو CIA مورد استفاده قرار گرفت. از 20 گله 10 گله مثبت(50%) و از 40 نمونه 14 نمونه مثبت (35%) ارزیابی شدند و همینطور می توان نتیجه گرفت که از 14 نمونه ی مثبت 4 گله هم بورسشان و هم طحالشان مثبت بوده (40%)و 6 گله تنها یکی از ارگان هایشان مثبت بودکه از این 6 گله 4 گله طحال مثبت بود(40%) و 2 گله بورسشان مثبت بود(20%). از آن جا که بیماری کم خونی عفونی جوجه ها بیماری بسیار مهمی است و با توجه به نتایج بدست آمده در مطالعه ی حاضر 50% گله ها به لحاظ مولکولی حاوی این ویروس بودند بنابراین نتایج بایستی در زمینه پایش و حضور بیماری،کنترل آن و پیشگیری و واکسیناسیون به طور جدی اقدام گردد تا از وارد آمدن خسارات بیشتر به صنعت طیور استان جلوگیری به عمل آید.

کلمات کلیدی: CIA،طیور گوشتی،گرمسار،PCR، بورس،طحال

 

 

 

 

 

فصل اول:

 

کلیات پژوهش

 

 

 

  1-1طبقه بندی و مورفولوژی

 

اولین بار که  CIA درژاپن جدا شد محققین نشان دادند که عامل از فیلترهای با منافذ به قطر 25 نانومتر عبور میکند و حتی با بکار بردن صافی های پی درپی و کاهش قطر منافذ قسمت قابل توجهی از عفونت باقی می ماند. ذرات ویروسی در محلول سدیم کلراید در دانسیته cm3/g36/1- 35/1 باند تشکیل میدهند  که این عدد خیلی پائین تر از دانسیته پارو ویروس ها می باشد با استفاده از میکروسکوپ الکترونی کنتراست منفی باند تشکیل شده را مورد آزمایش قرار دادند و ذرات شبه ویروسی کروی یا هشت وجهی که قطری بین 22-18 نانومتر داشتند مشاهده کردند. در گزارش دیگری اندازه CIA با رنگ آمیزی منفی مایع روی محیط های کشت قطر 24-19 نانومتر بیان شده است  . گزارش اندازه های مختلف ویریون های CIA احتمالا مربوط به رنگ امیزی های منفی بکار برده شده می باشد با استات اورانیل که بهترین حلال ساختمانهای سطحی است قطر های 25 و 26 نانومتر ( 1) گزارش شده در صورتیکه با فسفوتنگستات اندازه 1/19 نانومتر  و 7/21 نانومتر بدست آمده است ژنوم CIA حاوی DNA حلقوی تک رشته ای با سنس منفی است. که اندازه اش با میکروسکوپ الکترونی حدود kb43% +–  170/2 و kb174/2  و بوسیله  ژل آگارز قلیایی 3/2 کیلوباز  تخمین زده شده است. تحقیقات انجام شده در بلفاست و برلین نشان داده است که کپسید های CIA  محور تقارن 3 تایی 5 تایی دارند.

 

با توجه به اندازه و طبیعت  ژنوم CIA و همانطور که اکثر محققین اشاره کرده اند بسیاری از مشخصات CIA شبیه پاروویروس ها نیست و CIA بسیاری از مشخصات هسته  پاروویروس ها  را ندارد. (ابتدا معتقد بودند که CIA پاروویروس است) به همین دلایل ویروس مولد کم خونی جوجه ها مدت ها طبقه بندی نشده باقی مانده بود. تا اینکه آن را در یک خانواده جدید بنام سیرکوویریده در این خانواده سه ویروس قرار دارند. که عبارتند از Chicken infection Anemia(CIA)، (P.B.F.D.V) Psittaction  و Procine Circovirus (PCV). عامل خونی عفونی ویروسی است کوچک ، بدون غشا با DNA حلقوی تک رشته ای . 

خرید متن کامل این پایان نامه در سایت nefo.ir

 

 

 

 

 

 

1-2مقاومت به عوامل فیزیکی و شیمیایی

 

CIA به حلالهای چربی و به طور قابل توجهی نسبت به حرارت مقاوم است،نسبت به حرارت ◦C 56 مقاوم بوده و در c◦ 70 یک ساعت، ◦c80 را در 15 دقیقه تحمل میکند اما مقاومت کمی در ◦c80 به مدت 30 دقیقه نشان میدهد.

 

CIA جدا شده در آمریکا در حرارت ◦C 56 حداقل به مدت 30 دقیقه عفونت زایی خود را حفظ میکند سه سویه جدا شده از استرالیا حرارت c◦ 70  را به مدت 5 دقیقه تحمل کردند اما CIAدر◦C 100 ظرف 15 دقیقه کاملا غیر فعال میشود . آلودگی وسایل آلوده به ویروس به سرعت بافنل 50% ظرف 5 دقیقه از بین میرود احتمالا میزان مقاومت CIA های موجود در کبد خام هموژنیزه یا سلولهای محیط کشت حاوی CIA با هم متفاوت بوده است. یوآسا گزارش کرد که CIA در c◦ 37 به مدت 2 ساعت در برابر محلولهای 5% از ضدعفونی کننده های تجارتی شامل ترکیبات چهارتایی آمونیوم ، صابون آمفوتر و ارتودی کلروبنزن مقاوم است. عفونت زایی CIA با استفاده از یدوفور و فرمالین کاهش می یابد ولی از بین نمی رود اما با استفاده از هیپوکلریت کاملا نابود میشود و با سدیم دو دسیل سولفات 10% یا نانی دت p-4010% در c◦  37 به مدت یک ساعت خیلی کم کاهش می یابد.

 

چندین سال بعد همین محقق تجربه دیگری روی مواد کبدی و محیط کشت حاوی CIA انجام داد و نتیجه گرفت که هیچکدام از ضدعفونی کننده های تجارتی شامل صابون اینورت صابون آمفومتر و ارتودی کاروبنزن با اضافه شدن به کشت بافت یا مواد کبدی حاوی CIA حتی وقتی با غلظت 10% بکار برده شوند روی ویروس موثر نمی باشند.

 

محلول 1% ید یا هیپوکلریت سدیم CIAهای موجود در کشت بافت را غیرفعال می کنند اما هیچ اثری روی CIA های موجود در کبد هموژن ندارند اما اگر با غلظت 10% بکار برده شوند در کبد موجب غیر فعال شدن CIA خواهند شد. استفاده از حلال های ارگانیک در کشت بافت و مواد کبدی هیچ تاثیری روی CIA نداشته و میزان عفونت زایی TCID 50log5 در هرcc 1% مقاوم است. اسید قوی (Hcl) یا باز قوی (NoOH) CIA موجود در مواد کبدی را بطور کامل غیر فعال نمیکند مواد کبدی و کشت بافت بوسیله فرمالدئید 5 % به مدت 24 ساعت در حرارت اتاق غیر فعال میشوند. دود دادن مواد کبدی و کشت بافت حاوی CIA با فرمالدئید CIA را بطور کامل غیرفعال نمیکنند (cc40 محلول 35% فرمالدئید + gr20 پرمنگنات پتاسیم برای هرمتر مکعب) .

 

این مواد حاوی CIA وقتی تحت تاثیر اتیلن اکسید در حالت مایع هیچگونه عفونت زایی را نشان نمیدهند اما اگر آنها را در ظرف پتری نگهداری نمود تا خشک شوند حتی پس از تاثیر اتیلن اکسید نیز عفونت زایی مشخص مشاهده می گردد.

 

نمونه ای از CIA با تیتر مشخص به مدت 24 ساعت در حرارت محیط در مجاورت استن 90% قرار دارند سپس با تیتر کردن فراورده فوق در محیط کشت سلولی MDCC-MSB1 معلوم شد که CIA به استن بسیار مقاوم است.

 

1-3همانند سازی ویروس

 

همانند سازی ویروس در هسته انجام شده  و وابسته به پروتئین های فاز S  چرخه سلولی می باشد ازدیاد CIA در سلول های MSB1 با شدت رشد سلول ها تفاوت میکند  به نظر می رسد عامل کم خونی عفونی ابتدا در سلول های پیشگام خونساز در مغز استخوان و سلول های پیشگام تیموسی در قشر تیموس جوجه ها شروع به افزایش می کنند که عفونت سلولی در این قسمت ها  مشاهده شده است .

 

انجام تجربه دیگری نشان داد که CIA در لنفوبلاست های تیموسی هموبلاست های داخل و خارج سینوزوئیدی و سلول های رتیکولر همانند سازی می کنند  تخلیه شدید لنفاوی لنفوسیت های تیموسی  و انتشار آنتی ژن  ویروس در تیموس و مغز استخوان نشان میدهند که سلولهایی لنفوئیدی تیموس بافت هدف CIA می باشند  حدس می زنند سلول های بنیادی مغز استخوان که اجداد سلول های لنفوئید تیموس هستند نیز بافت هدف CIA باشند .

 

1-4میزبان آزمایشگاهی

 

CIA میتواند در جوجه های یک روزه و کشت سلولی تکثیر و تزاید پیدا کند و همچنین می تواند در جنین جوجه ها زیاد شود ولی در این صورت ایجاد ضایعات ماکروسکوپیک نمیکند.

 

 

 

 

 

جوجه

 

در یک آزمایش CIA های جدا شده را از راه داخل عضلانی به جوجه های یک روزه فاقد آنتی بادی مادری تلقیح کردند تمام این سویه ها به جز یکی از آنها که از آمریکا جدا شده بود  در اکثر جوجه های تلقیح شده ایجاد آنمی یا مغز استخوان آپلاستیک نمود.

 

قدرت ایجاد آنمی بصورت تجربی مستقیما” در ویروس تلقیح شده ارتباط داشته است، در یک مورد استثنائا” کمتر از 25% جوجه های تلقیح شده کم خونی را نشان میدهد . که احتمالا اختلاف واقعی در پاتوژنسیته ویروس نبوده بلکه ممکن است اثر دز ویروس مصرفی باشد.

 

جنین جوجه

 

14 روز پس از تلقیح ویروس CIA در کیسه زرده جنین جوجه 5 روزه بالاترین تیتر CIA از تمام قسمت های جنین به جز پرده کوریو آلانتوئیک و کیسه زرده میتوان جدا کرد  جنین هایی که بدین طریق تلقیح می شوند بطور طبیعی از تخم خارج می شوند اما 7 روز پس از هچ کم خون شده و در سن 15-10 روزگی می میرند بیماری ناشی از تلقیح ویروس در کیسه زرده شدیدتر از بیماری حاصل از تلقیح CIA در سن یک روزگی خواهد بود.

 

کشت سلولی

 

CIAدر کشت های یک لایه تهیه شده از بافت های جوجه و جنین آنها  یا درواریته های متداول مورد استفاده تهیه شده از رده های سلولی پستانداران رشد نمی کنند  یوآسا کشف کرد که سلول های لنفوبلاستوئید رده های MDCC-MSB1 T و MDCC-JP2  و لنفوپلاستوئید رده های LSCC-1104B1 B برای کشت و تکثیر CIA مناسب می باشند این سلول ها از لنفوبلاستوئیدهای بیماری مارک و لکوز لنفوئید بدست آمده اند.

 

MDCC-MSB رایج ترین سلول های مورد استفاده هستند که از لنفومای سلول های T  طحال ابتلا به بیماری مارک منشاء گرفته اند. بسیاری دیگر از رده های لنفوبلاستوئیدی T-cell و B-cellکه مورد آزمایش قرار گرفته اند نسبت به  CIA مقاوم بوده اند.

 

همچنین کشت های سلولی متفاوتی که از انواع بافت های جوجه ها و جنین آن ها تهیه شده مورد استفاده قرار گرفت ولی نشان داده شد که نسبت به عفونت CIA مقاومند.

 

اوج آلودگی داخل سلولی معمولا” 42-36 ساعت پس از تلقیح مشاهده می گردد که بالاترین مقدار آنتی ژن داخل هسته ای همراه است و با بالاترین تیتر ویروسی در خارج سلول 48-72ساعت پس از تلقیح ایجاد میشود.

 

میزان افزایش ویروس 100-10 برابر گزارش شده است  سلول های تلقیح شده سوسپانسیون محیط کشت رشد می کنند و لازم است هر 3-2 روز یکبار تجدید کشت شوند کشت های آلوده به CIA سرانجام با CPE که بصورت سلول های بزرگ ، متورم ، تخریب سلولی ، قلیایی شدن محیط و عدم توانایی رشد در تجدید کشت مشخص می شوند مشاهده می گردند.

 

تکثیر CIA در سلول های MSB1 با تیترهای پائین ویروس (حدود TCID 50 106– 105  در cc1% ) کند می باشد و برای تعییین آخرین تیتر عفونت زای CIA 10-7 بار تجدید کشت سلول های تلقیح شده لازم است. بلو و فوش گزارش کردند که پاتوژن CIAبرای جوجه ها بعد از پاساژو گریو پس از 40 پاساژ مدرکی مبنی برکم شدن پاتوژنز ویروس کم خونی هستند.