1-1- شیر………………………………………………………………………………………………… 2

 

1-2- ترکیبات شیر………………………………………………………………………………………………………………… 4

 

1-3- پروتئین­های شیر…………………………………………………………………………………………………………. 5

 

1-3-1- پروتئین­های آب پنیر………………………………………………………………………………………… 6

 

1-3-2- کازئین­ها…………………………………………………………………………………………………………….. 7

 

1-3-3- کازئین­بتا…………………………………………………………………………………………………………….. 9

 

1-4- فعالیت­های زیستی کازئین­ها…………………………………………………………………………………….. 11

 

1-4-1- فعالیت چاپرون کازئین­های شیر…………………………………………………………………….. 11

 

1-4-2- پپتیدهای فعال زیستی……………………………………………………………………………………. 12

 

1-4-2-1- پپتیدهای فعال زیستی…………………………………………………………………………. 12

 

1-4-2-2- منابع اصلی پپتیدهای فعال زیستی…………………………………………………….. 12

 

1-4-2-3- برخی از خواص پپتیدهای فعال زیستی…………………………………………….. 12

 

1-4-2-3-1- خاصیت ضد فشار خون……………………………………………………………… 12

 

1-4-2-3-2- فعالیت آنتی­اکسیدانی………………………………………………………………… 14

 

1-5- مشکلات ناشی از مصرف شیر در افراد…………………………………………………………………….. 15

 

1-5-1- عدم تحمل لاکتوز……………………………………………………………………………………………. 15

 

1-5-2- آلرژی به پروتئین­های شیر……………………………………………………………………………… 16

 

1-5-2-1- معرفی انواع آزمون­های رایج جهت مطالعه­ی فرآیند آلرژی……………… 18

 

1-5-2-2- آزمون الایزا……………………………………………………………………………………………. 19

 

1-6- قندی شدن غیرآنزیمی پروتئین­ها……………………………………………………………………………. 20

 

فصل دوم: مروری بر پژوهش­های پیشین………………………………………. 23

 

فصل سوم: مواد و روش­های تحقیق

 

3-1- مواد مصرفی………………………………………………………………………………………… 27

 

3-2- تهیه­ی محلول­ها……………………………………………………………………………. 28

 

3-2-1- تهیه­ی محلول­های کازئینی، کازئین­بتا و تعیین غلظت آن­ها………………………. 28

 

3-2-2- تهیه­ی محلول برادفورد و رسم نمودار استاندارد آن با

 

 استفاده از کازئین­بتا……………………………………………………………………………. 28

 

3-2-3- تهیه­ی محلول­های مورد نیاز برای الکتروفورز ژلی………………………………………… 30

 

3-2-3-1-تهیه محلول SDS 20 درصد………………………………………………………………… 30

 

3-2-3-2- تهیه محلول آمونیوم پر سولفات (APS)……………………………………………… 30

 

3-2-3-3- تهیه محلول آکریلامید و بیس آکریلامید…………………………………………… 31

 

3-2-3-4- تهیه بافر تریس 5/1 مولار…………………………………………………………………… 31

 

3-2-3-5- تهیه بافر تریس 5/0 مولار…………………………………………………………………… 31

 

3-2-3-6- تهیه بافر تانک به حجم 500 میلی­لیتر……………………………………………… 31

 

3-2-3-7- تهیه بافر نمونه X2………………………………………………………………………………. 32

 

3-2-3-8- تهیه 100 میلی­لیتر محلول کوماسی­بلو……………………………………………… 33

 

3-2-3-9- تهیه محلول رنگ بر ژل………………………………………………………………………… 33

 

3-2-4- تهیه محلول OPA به حجم 50 میلی­لیتر……………………………………………………. 33

 

3-2-5- تهیه محلول فلورسامین…………………………………………………………………………………… 34

 

3-2-6- تهیه محلول ANS…………………………………………………………………………………………… 35

 

3-2-7-  تهیه محلول ABTS رادیکال…………………………………………………………………………. 36

 

3-2-8- تهیه عصاره­ی ACE از پودر استون شش خرگوش……………………………………… 37

 

3-3-روش­ها………………………………………………………………………………………… 38

 

3-3-1- تخلیص کازئین­بتا شیرگاو……………………………………………………………………………….. 38

 

3-3-2- تخلیص هموگلوبین A از خون انسان……………………………………………………………. 39

 

3-3-3- تعیین میزان خلوص پروتئین با استفاده از SDS-PAGE…………………………… 40

 

3-3-4- تهیه پودر استون شش خرگوش…………………………………………………………………….. 40

 

3-3-5- قندی کردن کازئین­بتا و کازئین­های شیرگاو به روش غیرآنزیمی………………. 41

 

3-3-6- آزمون­های OPA و فلورسامین برای تایید فرآیند

 

قندی شدن غیرآنزیمی………………………………………………………….. 41

 

3-3-7- مطالعه­ی فلورسانس ذاتی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی……………………. 42

 

3-3-8- مطالعه­ی فلورسانس عارضی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی……………….. 43

 

3-3-9- مطالعه تغییرات ساختاری کازئین­های بتای قندی و غیرقندی،

 

با استفاده از دستگاه دورنگ نمایی دورانی………………………………………. 43

 

3-3-10- مطالعه­ی فعالیت چاپرونی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی………………… 44

 

3-3-11- هضم کازئین­های شیرگاو و کازئین­بتای قندی و غیرقندی

 

به وسیله­ی آنزیم­های تریپسین و کیموتریپسین پانکراس گاوی…………………………………. 44

 

3-3-12- مطالعه­ی فعالیت آنتی­اکسیدانی کازئین­های شیرگاو کازئین­بتای

 

 قندی و غیرقندی…………………………………………………………………………. 45

 

3-3-13- مطالعه­ی فعالیت مهار آنزیم ACE به وسیله­ی کازئین­بتا

 

 قندی و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم آنزیمی آن­ها……………………………………… 47

 

3-3-14- مطالعه­ی توان آلرژی­زایی کازئین­ها و کازئین­بتای قندی

 

 و غیرقندی……. 47

 

3-3-15- آزمون آماری…………………………………………………………………….. 48

 

 فصل چهارم: نتایج و بحث

 

4-1- مطالعه اثر قندی شدن غیرآنزیمی بر ساختار، فعالیت­های زیستی

 

(چاپرونی، آنتی­اکسیدانی و مهار آنزیمACE ) و آلرژی­زایی کازئین­بتا………………………………. 50

 

4-1-1- تخلیص پروتئین کازئین­بتا………………………………………………………………………………. 50

 

4-1-2- تخلیص هموگلوبینA از خون انسان……………………………………………………………… 51

 

4-1-3- مطالعه فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی کازئین­بتا

 

در حضور ماده­ی احیا کننده………………………………………………… 52

 

4-1-3-1- مطالعه­ی قندی شدن کازئین­بتا با استفاده از ترکیب OPA……………… 53

 

4-1-3-2- مطالعه فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی کازئین­بتا با استفاده 

خرید متن کامل این پایان نامه در سایت nefo.ir

 

 

 از ترکیب فلورسامین…………………………………………….. 54

 

4-1-3-3- استفاده از ژل SDS-PAGE احیایی برای تایید فرآیند

 

قندی شدن غیرآنزیمی کازئین­بتا……………………………………………………………………………… 55

 

4-1-4- مطالعه­ی فلورسانس ذاتی و عارضی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی…… 56

 

4-1-5- مطالعه ساختار دوم کازئین­های بتای قندی و غیرقندی با استفاده

 

از دستگاه دورنگ نمایی دورانی………………………………………………………………………………………. 58

 

4-1-6- مطالعه فعالیت چاپرونی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی………………………. 60

 

4-1-7- هضم آنزیمی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی با آنزیم­های

 

 تریپسین و کیموتریپسین………………………………………………………………………………………………. 62

 

4-1-7-1- تایید فرآیند هضم آنزیمی با استفاده از ژلSDS-PAGE

 

(15درصد) احیایی……………………………………………………………………………………………………… 63

 

4-1-7-2- مطالعه فعالیت آنتی­اکسیدان کازئین­های بتای قندی

 

 و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم آن­ها………………………………………………………… 65

 

4-1-7-3- مطالعه خاصیت مهار آنزیم ACE به وسیله­ی کازئین­های

 

بتای قندی و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم آنزیمی آن­ها………………………… 71

 

4-1-8- مطالعه آلرژی­زایی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی و پپتیدهای

 

حاصل از هضم آنزیمی آن­ها…………………………………………………………………………………………… 73

 

4-2- مطالعه اثر قندی شدن غیرآنزیمی بر ساختار، فعالیت آنتی­اکسیدانی

 

 و آلرژی­زایی کازئین­های شیرگاو…………………………………………………………………………………………. 77

 

4-2-1- جداسازی و قندی کردن کازئین شیرگاو……………………………………………………….. 77

 

4-2-2- تایید فرآیند قندی شدن کازئین­های شیرگاو……………………………………………….. 77

 

4-2-2-1- استفاده از ژل SDS-PAGE (12 درصد) برای تایید

 

 قندی شدن غیرآنزیمی…………………………………………………………………………………………….. 77

 

4-2-2-2- استفاده از ترکیب OPA برای مطالعه­ی قندی شدن غیرآنزیمی

 

کازئین­های شیرگاو……………………………………………………………………………………………………… 78

 

4-2-3- هضم آنزیمی کازئین­های قندی و غیرقندی شیرگاو با آنزیم­های

 

 تریپسین و کیموتریپسین………………………………………………………………………………………………. 80

 

4-2-4- مطالعه فعالیت آنتی­اکسیدان کازئین­های قندی و غیرقندی شیرگاو

 

 و پپتیدهای حاصل از هضم آن­ها………………………………………………………………………………….. 82

 

4-2-5- مطالعه آلرژی­زایی کازئین­های قندی و غیرقندی شیرگاو و پپتیدهای

 

 حاصل از هضم آنزیمی آن­ها به وسیله­ی دو آنزیم تریپسین و کیموتریپسین………….. 86

 

 

 

خلاصه­ی نتایج ………………………………………………………………………………. 90

 

 نتیجه­گیری نهایی……………………………………………………………………………………. 91

 

فهرست منابع و مآخذ       92

 

شیر

 

شکل1-1- نمایی از ترکیبات موجود در شیر.

 

 

 

1-2- ترکیبات شیر

 

جدول1-1- ترکیبات سازنده شیر جانوران مختلف بر حسب درصد.

 

 

 

1-3- پروتئین­های شیر

 

اکثر پروتئین­های شیر در طول زمان شیردهی بوسیله­ی سلول­های پوششی غدد پستانی تولید و ترشح می­شود. این سلول­ها علاوه بر پروتئین، ترکیبات دیگری مانند چربی (تری­آسیل گلیسرول[3] و دی­گلیسرول[4]) و کربوهیدرات (لاکتوز[5]) را نیز تولید و ترشح می­کنند (Bouguyo و همکاران 2006، De Kruif و همکاران 2003).

 

پروتئین­های شیر از نظر ارزش غذایی و فعالیت زیستی بسیار حائز اهمیت هستند و به دو گروه کازئین­ها (آلفا S1، آلفا S2، بتا و کاپا کازئین) و پروتئین­های آب­پنیر (آلفالاکتالبومین[6]، بتا لاکتوگلوبولین، سرم آلبومین[7] و ایمونوگلوبولین[8]) تقسیم می­شوند. کازئین­های شیر گاو 80 درصد و پروتئین­های آب­پنیر بین20 تا 45درصد کل پروتئین­های شیر انسان را تشکیل
می­دهند ( Kunz و همکاران 1990، Wong و همکاران 1996).

 

شکل1-2- پروتئین­های تشکیل دهنده شیرگاو.

 

1-3-1- پروتئین­های آب­پنیر

 

پروتئین­های آب­پنیر از نوع کروی هستند که حدود 20 درصد پروتئین­های شیر را شامل می شوند. از لحاظ ساختاری این پروتئین­ها دارای مقدار قابل توجهی مارپیچ­آلفا[9] در ساختارشان می­باشند.

 

آمینواسید­های اسیدی، بازی، آبگریز[10] و آبدوست[11] به صورت نسبتا متعادل در طول زنجیره ی پلی­پپتیدی این پروتئین­ها وجود دارد. این پروتئین­ها در محیط آبی شیر  به صورت محلول هستند (Evans، 1982).

 

پروتئین­های آب­پنیر شامل بتالاکتوگلوبولین، آلفالاکتالبومین، ایمونوگلوبولین، آلبومین سرمی، لاکتوفرین[12] و لاکتوپراکسیداز[13] می­باشد که غلظت و درصد این پروتئین­ها در شیر نسبت مستقیم با نوع آب­پنیر شامل اسیدی با pH پایین تر از 1/5 و بازی با pH بالاتر یا مساوی 6/5، منبع شیر ( گونه­ی حیوان)، زمان سال، نوع خوراک حیوان و مرحله­ی شیردهی دارد (Pintado 2001).