کلید واژه­ها: سلول ­های بنیادی مزانشیم مغز استخوان، اسید بوریک، قابلیت حیات، آنزیم­های متابولیکی، تمایز

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

خرید متن کامل این پایان نامه در سایت nefo.ir

	فصل اول: کلیات و هدف
1	1-1  سلول­های بنیادی ………………………………………………………………………
1	1-1- 1 تعریف سلول­های بنیادی…………………………………………..
2	1-1-2 ویژگی خودنوزایی سلول بنیادی…………………….
3	1-1-3 دسته­بندی سلول­های بنیادی بر اساس توان تمایزی آنها ……………………………………………………….
4	1-1-4 دسته­بندی سلول­های بنیادی بر اساس منشا ……………………………………………………..
4	1-1-4-1 سلول­های بنیادی جنینی…………………………………………………
6	1-1-4-2 سلول بنیادی خون بند ناف………………………………………..
7	1-1-4-3 سلولهای بنیادی بزرگسالان………………………..
10	1-1-5 سلول­های مغز استخوان ……………………………….
10	1-1-5-1 سلول­های بنیادی خونساز…………………………..
11	1-1-5-2 سلول مزانشیم مغز استخوان……………………………..
12	1-2  تاریخچه سلول بنیادی مزانشیم ………………………………..
13	1-2-1 مورفولوژی سلول بنیادی مزانشیم …………………………..
14	1-2-2 کنام سلول بنیادی مزانشیم مغز استخوان ……………………………………..
15	1-2-3 ویژگی­های اساسی سلول بنیادی مزانشیم …………………….
16	1-3  کاربردهای سلول بنیادی مزانشیم در درمان ………………..
17	1-3-1 ترمیم استخوان ……………………………………………….
17	1-4 بافت استخوان ……………………………………………..
20	1-5 استئوژنز(استخوان‌سازی) ……………………………..
21	1-5-1 استخوان­سازی اولیه یا جنینی ………………………..
23	1-5-2 استخوان­سازی ثانویه ………………………………………………..
23	1-5-3 دوباره­سازی استخوان …………………………………………..
24	1-6 هتروژن بودن کشت سلول بنیادی مزانشیمی ……………..
25	1-6-1 شرایط آزمایشگاهی تمایز مزانشیم به استخوان ………………………………………………
25	1-6-2 تنظیم مولکولی تمایز به استخوان سلول‌های بنیادی مزانشیمی ……………………………………………..
27	1-6-3 نقش سیگنال دهی Wnt در تمایز سلول های بنیادی مزانشیم به استخوان …………………………
29	1-7 عنصر بور ……………………………………..
30	1-7-1 مشتقات بور ………………………………………………………..
32	1-7-2 فراوانی عنصر بور ………………………………………
32	1-7-3 تاریخچه مصرف بور ………………………………..
33	1-7-4 منابع طبیعی بور…………………………………
34	1-7-5 اثرات بور برفلزات ضروری برای متابولیزم در جانوران ………………………………………….
34	1-7-5-1 تاثیر بور بر فیزیولوژی بدن …………………………………..
36	1-7-5-2 تاثیر بور بر روی سرین پروتئازها ……………………………………………………..
37	1-7-6 کاربرد بور در دارو ………………………………………………
37	1-7-7 سرطان ……………………………………………………….
39	1-8 اثرات بور روی استخوان …………………………………….
40	1-9 بور و خون ………………………………………………………..
41	1-10 بور در گیاهان …………………………………………………………
42	1-11 سمیت بور …………………………………………….
44	1-12 محدوده استفاده بور ………………………………………………
45	مروری بر مطالعات گذشته ………………………………………
47	هدف مطالعه ……………………………………………………………..
	فصل دوم: مواد و روش­ها
50	2-1  انتخاب رت ……………………………………………………………….
50	2-2 جدا سازی وتكثیر سلول‌های بنیادی مزانشیم مغز استخوان …………………………………..
52	2-2-1 اجرای پاساژ ………………………………
54	2-3 اثبات مزانشیم بودن سلول های استخراج شده ……………………………………….
54	2-3-1 تمایز به استخوان …………………………………………………………….
55	2-4 بررسی توان زیستی سلولها (دوز فایندینگ) ………………………………
55	2-4-1  رنگ آمیزی تریپان بلو ………………………………………………..
57	2-4-2  سنجش تترازولیوم (MTT) …………………………………………………….
57	2-4-2-1 مراحل انجام سنجش MTT)غیر استئوژنیک( …………………………………………………………………..
58	2-4-2-2  ترسیم منحنی استاندارد با استفاده از سنجش تترازولیوم …………………………………………………
59	2-4-2-3 مراحل انجام تست MTT استئوژنیک …………………….
60	2-5  انتخاب دوز مورد نظر ………………………………………..
60	2-6 بررسی توان تکثیری سلول­های بنیادی مزانشیم …………….
61	2-6-1 سنجش توانایی کلونی­زایی ………………………………
63	2-6-2 محاسبه تعداد دوبرابرشدگی جمعیتی(PDN) ………………..
62	2-7 بررسی تغییرات مورفولوژیکی با استفاده از رنگ آمیزی فلوروسنت ……………………………………………..
65	2-8 آزمون­های بیوشیمیایی در شرایط تمایز و غیرتمایزی ………………………………………….
65	2-8-1تیمار و استخراج عصاره سلولی ………………………………
65	2-8-2 بررسی فعالیت آنزیم­ها ………………………………………
66	2-8-2-1 تهیه ی نمودار استاندارد برای آزمایش لاوری …………………………………….
66	2-8-2-2 ترانس آمینازها …………………………………
68	2-8-2-3 لاکتات دهیدروژناز…………………………………
70	2-8-2-4 آنزیم آلکالین فسفاتاز ………………………………………………
72	2-8-3 سنجش میزان رسوب ماتریكس معدنی به كمك رنگ آلیزارین رد در سلول های استئوژنیک
72	2-8-3-1  رسم منحنی استاندارد برای رنگ آمیزی آلیزارین رد ………………………..
73	2-8-3-2  بررسی رسوب ماتریکس استخوانی در نمونه های تیمار شده …………………………………
73	2-8-4  بررسی الکترولیت ها )کلسیم، سدیم و پتاسیم( …………………….
73	2-8-4-1 بررسی میزان کلسیم داخل سلولی با استفاده از کیت کلسیم به روش رنگ سنجی …………
74	2-8-4-1-1 مراحل  انجام تست کلسیم در سلول های تمایز یافته )استئوبلاست( …………………………..
75	2-8-4-1-2 مراحل انجام اندازه­گیری میزان کلسیم …..
76	2-8-4-2 اندازه­گیری غلظت سدیم و پتاسیم سلول استئوژنیک و غیر استئوژنیک …………………………..
81	2-9 تجزیه و تحلیل آماری داده ها …………..
	فصل سوم: نتایج
82	3-1 الف: نتایج مرحله اول …………………………………
82	3-1-1  رشد و تکثیر سلولهای بنیادی مزانشیم ……………………
82	3-1-2  اثر اسید بوریک بر توانایی زیستی سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت ……………………
85	3-1-3  بررسی مورفولوژی سلولهای تیمار شده ………………
87	3-1-4  نتایج توانایی کلونی زایی، تعداد دوبرابر شدگی جمعیت سلول ……………………………………………..
89	3-1-5  اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی ……
91	3-1-6  میزان الکترولیتها…………………………………………..
92	3-2  نتایج اثر دوزهای انتخابی اسید بوریک بر شاخص های تمایز به استئوبلاست …………………………..
92	3-2-1 توانایی زیستی سلولها در روند تمایز ………………………..
93	3-2-2 بررسی تغییرات مورفولوژیکی با استفاده از رنگ­آمیزی فلورسنت در نمونه­های  استئوژنیک
96	3-2-3 بررسی اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی سلولهای تمایز یافته ………………………………..
97	3-2-3-1  میزان معدنی شدن ماتریکس با سنجش رنگ آلیزارین رد ………………………………………………..
100	3-2-3-2  میزان رسوب کلسیم ……………………………………..
101	3-2-3-3  بررسی فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز ………….
101	3-2-3-2 بررسی فعالیت آنزیم آسپارتات و آلانین ترانس آمیناز ………………………………………………………..
103	3-2-3-5  بررسی فعالیت لاکتات دهیدروژناز ………………..
103	3-2-3-6  بررسی سطح الکترولیت های سلولهای استئوژنیک ……………………………………………
	فصل چهارم: بحث و نتیجه­گیری
105	4-3 اثر اسیدبوریک بر سلولهای مزانشیم ………………………..
105	4-1-1اثر اسید بوریک بر توانایی زیستی و توان تکثیر سلولها ……………………………………………………
108	4-1-2 بررسی تاثیر اسید بوریک بر تغییرات مورفولوژیکی …………………………………………………………………
109	4-1-3 اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی ….
113	4-1-4  اثر اسید بوریک بر فعالیت آنزیمهای متابولیکی ………………………………………
116	4-2  اثر اسیدبوریک بر تمایز سلولی ………………………………
116	4-2-1 توانایی زیستی …………………………………….
119	4-2-2 بررسی سطح الکترولیت ها …………………………………………….
120	4-2-3  بررسی فاکتورهای استئوژنیک …………………….
124	4-2-4  بررسی اثر اسید بوریک بر آنزیم های متابولیکی …………..
127	4-2-5  تاثیر اسید بوریک بر مورفولوژی سلولهای تمایزی ……………………………………………..
128	4-3  نتیجه گیری ………………………………………………………
129	4-4 پیشنهادات …………………………………………………………….
	فصل پنجم:ضمیمه
131	5-1 روش تهیه محیط کشت ………………………………………………….
131	5-2  تهیه ی فسفات بافر سالین PBS– …………………………….
132	5-3 تهیه ی فسفات بافر سالین مثبت PBS+………………………
132	5-4 روش تهیه محیط تمایزی استئوژنیک …………………………..
133	5-5  آماده سازی آلیزارین رد ……………………………………………
133	5-6  روش تهیه محلول تریپان­بلو 4/0 درصد …………………………….
133	5-7  تهیه کریستال ویولت ………………………………………
133	5-8 روش تهیه محلول   MTT………………………………….
133	5-9  روش تهیه بافر شست و شو(  ( Tris-Hcl-NaCl…………………..
133	5-10 مواد لازم و روش تهیه بافر  استخراج ( Tris-Hcl) …………
134	5-11 روش تهیه بافر ARS ……………….
134	5-12 روش تهیه محلول BSA ……………………………
134	5-13   روش تهیه محلول کمپلکس لاوری …………
135	5-14  روش تهیه بافر استخراج کلسیم ………………………….
135	5-15 روش تهیه رنگ های فلورسنس هوخست و آکریدین اورنژ ….

تعریف سلول­های بنیادی

 

   به طور نرمال سلول­های تخصص یافته بدن مثل سلول پوست یا سلول عصبی در تمام دوره زندگی به همان صورت باقی می­مانند، اما در بدن سلول­های دیگری به نام سلول­های بنیادی وجود دارند که توانایی تبدیل به سلول­های دیگری چون سلول قلب، عصبی، ماهیچه و ……. را دارا می­باشند (1).

 

سلول­های بنیادی[1] سلول­هایی غیر تخصصی[2] در بدن هستند که قابلیت تمایز به سلول­های تخصص­یافته را با کسب کلیه اعمال سلولی تخصصی دارند. این سلول­ها دارای دو ویژگی اساسی یعنی توانایی تقسیم و تولید سلول­هایی با خواص یکسان (خودنوزایی)[3]و ایجاد انواع سلول­های تمایزیافته می‌باشند (شکل 1-1)(1).

 

 

شکل1-1: توانائی خودنوزائی و  پتانسیل تمایز در سلولهای بنیادی (www.cellingbiosciences.com)

 1-1-2 ویژگی خودنوزایی سلول بنیادی

 

   تکثیر یا خودتجدیدی، توانایی سلول­ها در تولید نسخه­های یکسان از خود، توسط تقسیم میتوز در یک دوره زمانی مشخص است به صورتی که خصوصیات ژنتیکی و کاریوتایپی در سلول­های دختری عینا شبیه سلول­های مادری باقی می­ماند.

 

خودتجدیدی سلول­ها بنیادی تحت تاثیر سیگنال­های درونی سلول بنیادی که به صورت تقسیم متقارن و نامتقارن است، قرار دارد. علاوه بر این سیگنال­های درونی، خودتجدیدی سلول­های بنیادی تحت تاثیر عوامل محیطی چون آسیب یا صدمه نیز می­باشد و تحت تاثیر این شرایط یک سلول بنیادی ممکن است دو سلول دختری ایجاد کند که یا به صورت سلول­های بنیادی باقی می­مانند یا متمایز می­شوند (2).

 

1-1-3 دسته­بندی سلول­های بنیادی بر اساس توان تمایزی آن­ها:

 

   سلول های بنیادی بر اساس توان تمایزی به صورت زیر دسته بندی می شوند:

 

الف) همه توان[4]: واژه Totipotent از دو قسمت Toti= همه، potent= توانایی تشکیل شده است. از جمله این سلول­ها می­توان بلاستومرهای یک جنین دو سلولی را نام برد که قادر است همه سلول­های بدن یک فرد کامل را بسازد. این سلول‌ها می‌توانند به انواع سلول‌های جنینی و برون جنینی تمایز پیدا کنند و اندام‌های قابل زیستی را ایجاد نمایند.

 

پ)چند توان[6]: سلولهای بنیادی هستند كه به تعداد محدودتری از انواع سلول‌ تمایز پیدا می­‌کنند (در بافت­های بزرگسال نظیر مغز، مغز استخوان، كبد و… وجود دارند).

 

ت) یک توان[7]: توانایی ایجاد یک نوع سلول را دارند ولی توانایی خود نوزایی خود را حفظ کرده­اند. مانند سلول­های بنیادی اسپرماتوگونی که توانایی تولید اسپرم را دارند (شکل 1-2) (3).

 

 

 

شکل 1-2: دسته­بندی سلول­های بنیادی براساس پتانسیل تمایزی آنها (www. njavan.com).

 

1-1-4 دسته­بندی سلول­های بنیادی بر اساس منشا

 

   سلول­های بنیادی بر اساس منشا به سه دسته اصلی تقسیم­بندی می­شوند

 

1-1-4-1 سلول­های بنیادی جنینی

 

  کشت موفقیت آمیز آزمایشگاهی سلول­های بنیادی جنینی انسانی (ESCs) [8] در سال 1998 توسط تامپسون و همکارانش انجام گرفت.

 

سلول­های بنیادی جنینی از توده سلولی داخلی (ICM)[9]جنین در مرحله بلاستوسیت به دست می­آیند. بلاستوسیت مرحله­ای از تکوین پیش از لانه­گزینی در پستانداران است که معمولا چهار تا پنج روز بعد از لقاح ایجاد می­شود. در این مرحله جنین 200-100 سلول دارد و به صورت کره­ای توخالی است. این کره متشکل از یک لایه سلولی برونی (تروفواکتودرم) است که به طور معمول پس از لانه­گزینی در رحم، بخشی از جفت را می­سازد. همچنین این کره مجتمعی از سلول­ها (حدود 30-20سلول) در داخل کره به نام توده سلولی داخلی است که قادرند لایه­های مختلف جنین کامل را تولید کنند (شکل 1-3) (4).

 

شکل 1-3: تصویر شماتیک از سلول­های بنیادی جنینی که توانایی ایجاد سلول­های هر سه لایه­ی زاینده­ی جنینی را دارا می­باشد و همچنین سلول­های بنیادی بالغ که توانایی خودنوزایی و تمایز را دارند (5) .

 

1-1-4-2 سلول بنیادی خون بند ناف[10]

 

   خون بند ناف غنی از سلول­های بنیادی و سلول­های خونساز است. این سلول‌ها بسیار پرتوان و نامیرا هستند و همچنین در اثر تکثیرهای پی در پی دچار پیری نمی‌شوند، به طوری­که با تزریق‌ و یا جایگزینی آنها در بافت‌‌هایی که آسیب جدی دیده‌اند می‌توانیم به بهبودی و تشکیل سلول‌های جدید بافت کمک نمائیم. خون بند ناف دارای 6/0 تا 1 درصد سلول‌های پیش‌ساز خونی و بنیادی خون‌ساز است. ژله وارتون بند ناف منبع غنی از موکوپلی­ساکاریدها بوده که سلول­های بنیادی بالغ نیز در آن یافت می­شود (6). خون بند ناف دارای مزایای زیادی چون محدود نبودن به اهداکننده، بلوغ کمتر سلول نسبت به سلول‌های فرد بالغ و کاهش احتمال پس­زدگی پس از پیوند می‌باشد (7). همچنین خون بند ناف را می‌توان ذخیره نمود و در موارد نیاز برای خود شخص یا فرد دیگری استفاده نمود. استفاده از این سلول‌ها در درمان بیماری‌ها چندان معمول نیست ولی این سلول‌ها در درمان دیابت نوع 1، بیماری‌های قلبی و عروقی، لوپوس اریتماتوس، بیماری‌های نورولوژیک مانند سکته مغزی، پارکینسون و آلزایمر، کم‌خونی‌ها و نقص ایمنی و بیماری‌های کبدی به کار می‌رود (شکل 1-4) (6).

 

 

 

شکل 1-4: نمایی از بند ناف (رگ‌های بند ناف (2 سرخرگ و یک سیاهرگ) و ژله وارتون[11] و غشا خارجی) (www.mdpi.com).

 

1-1-4-3 سلولهای بنیادی بزرگسالان (Adult stem cells):

 

انواع سلول بنیادی بالغ

 

بسیاری از بافت­های بالغ حاوی سلول­های بنیادی هستند و قدرت تمایز و توانایی خود نوزایی را دارند، به این سلول­ها سلول­های بنیادی بالغ گفته می‌شود. در زیر چند مثال از این نوع سلول‌ها آورده شده است:

 

الف) سلول بنیادی عصبی

 

   سلول بنیادی عصبی، سلول پرتوانی است که:

 

 1) قادر به تکثیر و تولید پیش‌سازهایی است که قابلیت تبدیل به سه نوع اصلی سلول‌های سیستم اعصاب مرکزی را دارند: یعنی آستروسیت‎‌ها، الیگودندروسیت‌ها و نورون‌ها.