صفحه

 

فصل اول: کلیات

 

خلاصه فارسی.. 1

 

فصل اول: کلیات

 

1-1: تاریخچه. 3

 

1-2: خصوصیات عمومی جنس هموفیلوس: 4

 

1-3: نیازهای غذایی.. 6

 

1-4: دسته بندی و تیپ بندی هموفیلوس آنفلونزا 8

 

1-4-1: بیوتایپ های هموفیلوس آنفلونزا: 8

 

1-4-2: سروتایپ های هموفیلوس آنفلونزا: 9

 

1-4-3: دیگر سیستم های دسته بندی: 9

 

1-5: خصوصیات پاتوژنیک… 9

 

1-5-1: آنتی ژن کپسولی.. 9

 

1-5-2: فاکتورهای ویرولانس و آنتی ژن های دیگر: 11

 

1-5-3: عوامل تشکیل کلنی و ویرولانس…. 12

 

1-6: علائم کلینیکی عفونتهای هوفیلوس آنفلونزا تیپ b.. 13

 

1-6-1: مننژیت… 15

 

1-7:درمان: 15

 

1-7-1: واکسن های موثر و مقایسه آنها 15

 

1-8: تشخیص: 18

 

1-8-1: روش کشت… 18

 

1-8-2: روش آگلوتیناسیون لاتکس (LAT). 19

 

1-8-3: روش مولکولی.. 19

 

1-9: ژنوم هموفیلوس آنفلونزا: 19

 

1-9-1: ژنوم مولد کپسول پلی ساکاریدی.. 21

 

1-9-1-1: منطقه I. 22

 

1-9-1-3: منطقه II. 22

 

1-9-1-2: منطقه III. 22

 

1-9-1-4: قطعه IS1016 23

 

1-9-1-5: تعداد کپی جایگاه cap. 24

 

1-9-1-6: تکامل ژنوم سویه های کپسول دار هموفیلوس آنفلونزا 25

 

1-9-1-7: ژنوتیپ های Hib.. 27

 

1-10: روش های تعیین تعداد کپی جایگاه cap در ژنوم هموفیلوس آنفلونزا: 28

 

1-11: Real-time PCR.. 28

 

1-11-1: تعریف و مفهوم : 28

 

1-11-2: مزایای روش Real-time PCR: 29

 

1-11-3: انواع روش های Real-time PCR: 29

 

1-11-4: روش های تعیین کمیت با Real-time PCR: 32

 

1-11-4-1: Absolute Quantification : 32

 

1-11-4-2: چگونگی رسم یک منحنی استاندارد: 32

 

1-11-4-3: Relative Quantification.. 33

 

1-11-5: کاربرد های Real-time PCR: 34

 

1-12: بیان مساله. 34

 

1-13: ضرورت انجام تحقیق.. 35

 

1-14: اهداف پژوهش…. 36

 

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

 

2-1: مطالعات انجام شده در ایران. 38

 

2-2: مطالعات انجام شده در خارج از ایران. 39

 

فصل سوم: مواد و روش ها

 

3-1: محیط های کشت… 43

 

3-1-1: محیط کشت شکلات آگار. 43

 

3-1-1-1: مواد و تجهیزات مورد نیاز. 43

 

3-1-1-2: روش تهیه 1000 میلی لیتر محیط کشت شکلات آگار. 43

 

3-1-2: محیط کشت آگار خون دار. 44

 

3-1-2-1: روش تهیه 1000 میلی لیتر محیط کشت شکلات آگار. 44

 

3-1-3: محیط کشت BHI+ supplement مایع.. 44

 

3-1-3-1: مواد و دستگاه های مورد نیاز. 44

 

3-1-3-2: روش تهیه 500 میلی لیتر محیط کشت  BHI+ supplemenمایع.. 44

 

3-2: کشت نمونه ها 45

 

3-3: فریز کردن باکتری.. 45

 

3-3-1: مواد و تجهیزات لازم. 45

 

3-3-2: روش فریز کردن. 45

 

3-4: شناسایی عمومی هموفیلوس آنفلونزا 46

 

3-4-1: تست نیاز های غذایی.. 46

 

3-4-2: رنگ آمیزی گرم. 46

 

3-4-2-1: مواد و تجهیزات لازم. 46

 

3-4-2-2: روش رنگ آمیزی گرم. 46

 

3-5: واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR). 47

 

3-5-1: استخراج DNA  از باکتری به روش جوشاندن. 47

 

3-5-1-1: مواد و تجهیزات لازم. 47

 

3-5-1-2: روش استخراج.. 48

 

3-5-2: پرایمرها 48

 

3-5-2-1: آماده سازی پرایمرها 49

 

3-5-3: برنامه PCR.. 49

 

3-5-4: تهیه مستر میکس PCR.. 50

 

3-5-4-1: مواد و تجهیزات لازم. 50

 

3-5-4-2: روش تهیه مسترمیکس…. 50

 

3-5-5: تهیه 500 میلی لیتر بافر TAE 10X.. 53

 

3-5-5-1: مواد و تجهیزات لازم. 53

 

3-5-5-2: روش تهیه بافر. 53

 

3-5-6: الکتروفورز محصول PCR.. 53

 

3-5-6-1: مواد و تجهیزات مورد نیاز. 53

 

3-5-6-2: تهیه ژل آگارز جهت الکتروفوز. 53

 

3-5-6-3: روش الکتروفورز محصول PCR.. 54

 

3-6: استخراج PRP. 54

 

3-6-1: مواد و تجهیزات مورد نیاز. 54

 

3-6-2: تهیه  ml50 محلول CTAB 0.5 M… 54

 

3-6-3: تهیه ml 50  محلول NaCl 0.4 M… 55

 

3-6-4: روش استخراج PRP. 55

 

3-7: اندازه گیری PRP به روش بیال. 56

 

3-7-1: مواد و تجهیزات لازم. 56

 

3-7-2: روش اندازه گیری PRP. 56

 

3-8:تعیین تعداد کپی cap با استفاده از Real-time PCR: 57

 

3-8-1: مواد و تجهیزات لازم: 57

 

3-8-2: شرایط واکنش: 57

 

3-8-3: کمیت سنجی مطلق(Absolute quantification): 59

 

3-8-3-1: انجام و تخلیص محصول PCR برای منحنی استاندارد. 59

 

3-8-3-2: تهیه منحنی استاندارد. 60

 

3-8-4: کمیت سنجی نسبی (Relative Quantification): 62

 

3-9: تعیین ژنوتیپ نمونه ها با استفاده از PCR : 62

 

فصل چهارم: نتایج

 

4-1: نتایج روش های تشخیص عمومی.. 65

 

4-1-1: نتایج نیاز غذایی.. 65

 

4-1-2: نتایج رنگ آمیزی گرم. 65

 

4-2: نتایج آزمون PCR.. 66

 

4-2-1: تایید هموفیلوس آنفلونزای کپسول دار بودن نمونه ها 66

 

4-2-2: تایید تیپ b بودن نمونه ها 68

 

4-2-3: نتیجه نهایی PCR.. 69

 

4-2-4: مشاهده سوش جهش یافته Hib‾ در میان نمونه ها 72

 

4-3: نتایج سنجش PRP  به روش بیال. 72

 

4-4: نتایج Real-time PCR.. 73

 

4-4-1: کمیت سنجی نسبی: 74

 

4-4-2: کمیت سنجی مطلق: 77

 

4-5: نتایج تعیین ژنوتیپ: 82

 

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

 

5-1: بحث و نتیجه گیری.. 84

 

5-3: پیشنهادات… 87

 

منابع  …   89

 

خلاصه انگلیسی.. 98

 

فهرست جداول

 

جدول 1-1: نیاز گونه های مختلف هموفیلوس به فاکتورهای مختلف به فاکتورهای X و V   7 

خرید متن کامل این پایان نامه در سایت nefo.ir

 

 

جدول 1-2: بیوتایپ های هموفیلوس آنفلونزا 8

 

جدول 3-1: لیست پرایمرها برای تایید Hib.. 48

 

جدول 3-2: برنامه PCR.. 50

 

جدول 3-3: مواد PCR.. 52

 

جدول3-4: پرایمرهای اولیگونوکلئوتیدی استفاده شده برای Real time PCR.. 58

 

جدول3-5: مواد واکنش برای Real-time PCR.. 61

 

جدول3-6 : برنامه واکنش Real-time PCR.. 61

 

جدول 3-7: پرایمر های مورد استفاده برای تعیین ژنوتیپ نمونه های منتخب… 63

 

جدول 3-8: برنامه دمایی واکنش PCR برای پرایمرهای K  و L.. 63

 

جدول 4-1: لیست نمونه ها و  نتایج PCR.. 70

 

جدول 4-2: میزان PRP نمونه های هموفیلوس آنفلونزا تیپ b.. 73

 

جدول 4-3 : نمونه های منتخب و میزان PRP. 74

 

جدول4-4: کمیت سنجی نسبی ژن rpoB و قطعه IS106 توسط Real-time PCR.. 75

 

جدول4-5: کمیت سنجی نسبی ژن rpoB و ژن capb توسط Real-time PCR.. 75

 

جدول4-6: نتایج مربوط به منحنی استاندارد جایگاه rpoB.. 78

 

جدول 4-7: نتایج مربوط به منحنی استاندارد جایگاه capB.. 78

 

جدول 4-8:  نتایج مربوط به منحنی استاندارد جایگاه IS1016. 78

 

جدول4-9: نتایج کمیت سنجی مطلق (تعداد کپی) جایگاه های rpoB, IS1016 و capB 79

 

جدول 4-10 : تعداد کپی جایگاه های capb و IS1016  نسبت به جایگاه تک کپی rpoB 80

 

فهرست تصاویر

 

شکل1-1: انتشار باسیل های گرم منفی، هموفیلوس و سایر باکتریهای نرمال و سخت رشد. 5

 

شکل 1-2: تست نوارهای X ، V و XV.. 7

 

شکل 1-3: ساختار پلی ساکارید های کپسولی هموفیلوس آنفلونزا (تیپ های a-f). 10

 

شکل 1-4: تظاهرات کلینیکی بیماریهای با عامل Hib بصورت درصد. 14

 

شکل 1-5: کشورهایی که از سال 1997 تا 2012 به برنامه واکسیناسیون علیه Hib پیوستن   18

 

شکل 1-6: نقشه ژنتیکی حلقوی Haemophilus influenza Rd.. 20

 

شکل 1-7: ساختار ژنتیکی جایگاه cap در هموفیلوس آنفلونزا سروتایپ های a,b,c,d,e,f. 21

 

شکل 1-8: جایگاه cap و ژن های تشکیل دهنده 24

 

شکل 1-9 : درخت تکاملی سویه های کپسول دار هموفیلوس آنفلونزا 26

 

شکل1-10 : تفاوت های بین ژنوتیپ I و II در جایگاه cap. 28

 

شکل 1-11: نحوه اتصال نشانگر سایبرگرین.. 30

 

شکل1-13: رسم منحنی استاندارد. 33

 

شکل 3-1: ویال های آماده برای PCR روی یخ.. 52

 

شکل 4-1: رشد باکتری در حضور دیسک XV  و عدم رشد در حضور دیسک X و V.. 65

 

شکل 4-2: رنگ آمیزی گرم نمونه ها نشان دهنده کوکوباسیل های گرم منفی.. 66

 

شکل 4-3: نتایج PCR برای ست پرایمر A و B 67

 

شکل 4-4: نتایج PCR برای ست پرایمر C  و D.. 69

 

شکل 4-5: مدل های پیشنهادی برای جایگاه capb  در نمونه های انتخاب شده 81

 

شکل4-6: نتایج PCR تعیین ژنوتیپ نمونه ها 82

 

فهرست نمودارها

 

نمودار 4-1: بیان نسبی capb نسبت به ژن مرجع rpoB…………………………………………………… 76

 

نمودار 4-2: بیان نسبی IS1016 نسبت به ژن مرجع rpoB………………………………………………….. 76

 

نمودار 4-3: تعداد کپی در دو جایگاه capB و IS1016 نسبت به جایگاه rpoB در نمونه ها……… 80

 

خلاصه فارسی

 

هموفیلوس آنفلونزای تیپ‌ب (Hib) از مهمترین عوامل ایجاد مننژیت باکتریال در نوزادان و کودکان می‌باشد. مهمترین عامل بیماری‌زایی این باکتری کپسول پلی‌ساکاریدی از جنس PRP می‌باشد که تولید آن تحت کنترل گروهی از ژنها می‌باشد که در جایگاهی به نام capb قرار دارند. واکسیناسیون علیه این بیماری در بیشتر کشورهای جهان انجام شده ولی ایران هنوز به طرح واکسیناسیون سراسری نپیوسته است، به همین دلیل تولید واکسن بومی هموفیلوس آنفولانزا یک ضرورت محسوب می‌شود. هدف از این مطالعه آنالیز مولکولی ژنوم باکتری برای انتخاب یک سویه بومی واکسینال می‌باشد. در این تحقیق ابتدا نمونه‌های مشکوک به روش PCR و با استفاده از 4 جفت پرایمر اختصاصی شناسایی شد، میزان PRP نمونه‌ها به روش بیال اندازه‌گیری شد، سپس تعداد کپی جایگاه cap در نمونه‌های منتخب به روش Real Time PCR و با استفاده از 3 جفت پرایمر طراحی شده برای مناطق IS1016، capb و ژن تک‌کپی rpoB با متد Abslute Quantification مشخص شد. در نهایت ژنوتیپ نمونه‌های منتخب با استفاده از دو جفت پرایمر اختصاصی مشخص شد.از میان 30 نمونه 18 مورد Hib ،11 مورد غیر از هموفیلوس آنفلونزا و یک مورد  Hib‾ تشخیص داده شد. از میان 5 نمونه منتخب دو نمونه دارای 3 کپی از جایگاه cap بوده و 3 نمونه دارای دو کپی از این جایگاه تشخیص داده شدند. در مرحله آخر تمام 5 نمونه ژنوتیپ I تشخیص داده شدند. در این مطالعه برای اولین بار در ایران تعیین تعداد کپی و ساختار ژنوم جایگاه cap در سویه‌های بومی انجام شد.

 

کلمات کلیدی: هموفیلوس آنفلونزا، Real time PCR، مننژیت ، Hib

 

فصل اول

 

کلیات