:

افزون بر 20% از اراضی کشاورزی و نزدیک به نیمی از زمین های آبی در دنیا متأثر از مشکل شوری هستند که این، عامل محدود کننده رشد و نمو گیاهان در سراسر جهان و مشکلی جدی برای تولید محصول کشاورزی می­باشد (28). شوری خاک یکی از مهمترین مشکلات محیطی است که تولید محصول زراعی را تحت تاثیر قرار می­دهد (51). لذا، فهم مکانیسم های تحمل به شوری بسیار با اهمیت است (15). عملکرد گیاهان زراعی تحت تأثیر تنش­های زنده و غیر زنده بیش از 50% کاهش می­یابد (146). افزایش شوری خاک یا آب موجب ایجاد اختلال در فرآیندهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه شده و باعث بروز مشکلاتی مانند 1) عدم تعادل یونی 2) کمبود مواد معدنی 3) تنش اسمزی 4) سمَیَت یونی و تنش اکسیداتیو می­گردد (64). این شرایط با اجزای سلولی همانند DNA، لیپیدها و رنگدانه ها اثر متقابل می­یابد (134) و رشد و نموَ اکثر گیاهان زراعی را کاهش می­دهد. تحمل نسبت به شوری صفتی چند ژنی است که شامل الف) تقسیم بندی مقادیر زیاد نمک در داخل گیاه ب) تنظیم اسمزی و ج) تغییرات مورفولوژیکی می­باشد (84). مطالعاتی که در زمینه تحمل به تنش شوری انجام گرفته است شامل: 1- برنامه های اصلاح کلاسیک که علی رغم برخی موفقیت­ها، به دلیل ماهیت چند ژنی بودن این صفت محدود گردیده است، 2- استفاده از موتاسیون­هایی که منجر به از بین رفتن و حذف عملکرد ژن می­گردند برای شناسائی و مطالعه ژن­های مسئول تنش. برای مثال در آرابیدوپسیس، به دلیل سهولت در دستکاری ژنتیکی این گیاه (6)، تحقیقاتی در این زمینه انجام گرفته است و 3- روش های کشت آزمایشگاهی در گیاهانی مانند یونجه (154)، برنج (77 و 155) و سیب زمینی (93) می­باشد. توسعه گیاهان دارای پتانسیل ژنتیکی بالقوه برای تحمل نسبت به این تنش، به کاهش استفاده از آب نیز کمک می­کند (27). افزایش گیاهان متحمل (124) همراه با مهندسی ژنتیک نتایج خوبی را از نظر احتمال انتقال سریع و دقیق صفات مطلوب به داخل گیاهان مورد نظر، بدون حضور ژن های مضر از خویشاوندان نزدیک گیاه، نشان داده است (111). زیرا در این روش، از انتقال مناطق ناخواسته کروموزومی ممانعت می­گردد (112 و 20). استفاده از ظرفیت داخلی گیاه، تحمل آن نسبت به این تنش را تقویت می­کند و مهندسی ژنتیک مدرن به انتقال صفات مطلوب کمک می­نماید (94). 

جو یکی از متحمل­ترین گیاهان زراعی است که طی سال­ها، از روش­های مختلف فیزیولوژیکی برای تعیین تنوع فنوتیپی تحمل به شوری در این گیاه استفاده شده است (149). ذخایر ژنی جوی زراعی در مقایسه با انواع وحشی آن تنوع ژنتیکی محدودی را نشان دادند که این امر بیانگر لزوم توسعه ارقام سازگار می­باشد (105). گزارش شده است که جمعیت هایی که در مناطق تحت تنش شوری رشد می­یابند دارای تنوع ژنتیکی گسترده­تری هستند (88). از نظر میزان محصول دانه در محیط شور، جو یکی از اعضای متحمل به شوری در تیره تریتیاسه است (69). مکانیسم تحمل به شوری در این تیره عموماً شامل تجمع یون سدیم در طول دوره رشد گیاه می­باشد (15 و 138). از نقطه نظر تجمع این یون در تیره تریتیاسه، گیاه جو دارای تنوع ژنتیکی بالایی است. شوری یکی از موانع اصلی افزایش تولید محصول در جو بوده و تحمل به این تنش در مراحل مختلف رشد گیاه متفاوت است. حساس­ترین مراحل رشد گیاه در مقابل تنش شوری در جو دو مرحله جوانه زنی و گیاهچگی می­باشد و با افزایش سن گیاه میزان تحمل آن نیز افزایش می­­یابد. تأثیر این تنش در مرحله جوانه زنی جو بیشتر مربوط به اثرات یونی است (134)، در حالیکه در مرحله گیاهچگی تنش شوری حاصل اثرات اسمزی می­باشد (74). بین تحمل به شوری در دو مرحله 

خرید متن کامل این پایان نامه در سایت nefo.ir

  رشدی جوانه­زنی و گیاهچگی هیچ رابطه­ای وجود ندارد (74). مکانیسم­های تحمل به شوری در جو شامل موارد زیر است: 1- انتقال یون سدیم از برگ­های گیاه جو به داخل واکوئول که موجب کاهش سمَیَت این یون می­شود (38) و 2- توزیع بیشتر یون پتاسیم موجود در برگ­های جو به داخل سلول­های مزوفیل نسبت به توزیع آن­ها در سلول­های اپیدرم که موجب افزایش نسبت یونی پتاسیم به سدیم در سیتوپلاسم سلول­های مزوفیل می­شود و این وضعیت برای ثبات فتوسنتز با اهمیت است (56).  

استراتژی­های حفاظت در مقابل آسیب ناشی از شوری در جو عبارت از استراتژی های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی است. تغییر عملکرد ژن راهی موثر برای تغییر این وضعیت است. بنابراین یک مرحله اساسی، درک مکانیسم مولکولی پاسخ به تنش است که در این مرحله، ژن­های کنترل کننده تنش و گیاهان ترانس ژنیک دارای تحمل بالا نسبت به این تنش شناسایی می گردند (65).   

تحمل به شوری در گیاهان می­تواند وابسته به عامل انتقال دهنده HKT[1] باشد که این مولکول اختصاصاً انتقال یون­های سدیم یا انتقال یون­های سدیم و پتاسیم را تسهیل می­نماید (86 و132) و در تنظیم هموستازی یون سدیم نقش مهمی ایفاء می­کند. در آرابیدوپسیس تالیانا تنها یک ژنHKT  (144) و در برنج 8 ژنHKT  (33 و 48) وجود دارد. این ژن براساس تشابه توالی آمینو اسیدی دارای دو زیر خانواده می­باشد (100) که آنها از نظر انتخاب دو یون سدیم و پتاسیم متفاوت هستند ((33، 48 و 72). اعضای ژنی زیر خانواده اول همگی اجزای انتقال دهنده اختصاصی یون سدیم بوده و اعضای زیر خانواده دوم انتقال دهنده همزمان دو یون سدیم و پتاسیم یا انتقال تک یون سدیم و یا پتاسیم می باشند به استثنای ژن OsHKT2,2 (Oshkt2) در برنج.

محققان گزارش دادند که تحمل نسبت به شوری به طور معنی داری با نسبت یون پتاسیم به یون سدیم مرتبط است (105). آنالیز ترکیبی نشان داد که HvHKT1 اصولاً انتقال یون سدیم را تحت شرایط تنش کنترل می­کند، که این نتیجه­گیری با آنالیز بیشتر بیان ژن تأیید گردید. همچنین گزارش شده است که در جمعیت­هایی که در محیط تحت تأثیر تنش رشد می­یابند، طیف وسیعی از تنوع ژنتیکی وجود دارد (88). در جو، مطالعه شده است که بیان ژن HKT1 به وسیله یون پتاسیم تنظیم می­شود (150). همچنین گزارش شده است که خانواده­های ژن HKT در هموستازی یون سدیم نسبت به یون پتاسیم دخالت می­نمایند که این نشان دهنده اهمیت آن­ها در تحمل نسبت به شوری است (43). چند مکانیسم در سازگاری­های مورفولوژیکی و بیوشیمیایی دخالت دارند که احتمالاً در حفظ نسبت پائین یون سدیم به یون پتاسیم در سیتوپلاسم نقش دارند. در جو (هوردئوم وولگار)، دو تا از این مکانیسم­ها وجود دارد که شامل انتقال یون سدیم به داخل واکوئول در عرض غشای تونوپلاستی و انتقال یون سدیم به محیط خارج در سراسر غشای پلاسمائی می­باشد (32 و 99). توزیع درون سلولی یون سدیم شامل پمپاژ این یون به داخل واکوئول قبل از افزایش غلظت آن در سیتوپلاسم است (138). این فرآیند از طریق یک شیب گرادیانت pH که به وسیله جابجایی پروتونی H+-ATPase و پیروفسفاتاز غیر آلی ایجاد می­گردد، تسریع می­شود (31، 37، 62 و 145). افزایش فعالیت آنتی­ریپورتر Na+/H+ به دلیل افزایش یون سدیم در ریشه­های هوردئوم وولگار گزارش شده است (32). مطالعات متعدد اخیر وجود تنوع در تحمل به شوری در میان ارقام هوردئوم وولگار را گزارش نموده است (66 و 115). تحمل به شوری در گیاهان بستگی به ترانسپورترهای HKT دارد که این ترانسپورترها واسطه انتقال اختصاصی یون سدیم یا انتقال همزمان یون سدیم و پتاسیم هستند. ترانسپورترهای HKT  دارای دو نقش می­باشند: 1- جذب یون سدیم از محلول خاک برای کاهش یون پتاسیم مورد نیاز هنگامی که یون پتاسیم عامل محدود کننده است و 2- کاهش تجمع یون سدیم در برگ­ها با انتقال آن­ها به داخل فضای آوند چوبی و یا انتقال آن­ها به داخل فضای آوند آبکش (113).

تکنیک اکوتیلینگ:

تعیین خصوصیات فنوتیپی جمعیت­های بزرگ یا مجموعه­های بزرگ بانک ژنی مشکل و دشوار است. راه­حل آن، استفاده از روشی برای صرفه جوئی در زمان و هزینه می­باشد. همچنین، توانایی عملی برای تأیید نقش توالی­های ژنی که از طریق برنامه­های بررسی بیان توالی ژن در آزمایشات بزرگ به دست می­آیند متناسب با سرعت کشف و یافتن آن­ها نمی­باشد. در نتیجه، تعداد زیادی توالی DNA وجود دارد که از طریق تفسیر الکترونیکی با ژن­ها یا پروتئین­هایی که قبلاً خصوصیات آن­ها تعیین شده همولوژی ندارند و بدین وسیله هیچ عملکرد بالقوه­ای برای آن­ها در نظر گرفته نمی­شود (11). به علت وجود اطلاعات زیاد در مورد توالی­های ژنی و فقدان آگاهی از عملکرد و نقش آن­ها، و نیز برای پر کردن فاصله بین ساختار و نقش این توالی­ها تحقیقات زیادی در زمینه ژنتیک معکوس انجام گرفته است (64). با استفاده از ابزار مولکولی و ژنتیکی، یک صفت موتانت با یک توالی از DNA که عملکرد آن قبلاً شناخته شده است، مرتبط می­گردد (17 و 46). اکوتیلینگ روشی است که با آن می­توان به سرعت و به سادگی پلی­مورفیسم­های طبیعی (پلی­مورفیسم­های تک نوکلئوتیدی (SNP) یا حذف و اضافه­های کوچک) را در ژن مورد نظر تعیین نمود (16). این تکنیک بر مبنای تشخیص موتاسیون است و اولین بار توسط کومای و همکاران معرفی گردید که در واقع از تکنیک تیلینگ برای یافتن موتاسیون­ در جمعیت طبیعی آرابیدوپسیس تالیانا استفاده گردید. این روش برای جو(Hordeum vulgar L.)  (76)، هندوانه (Cucumis melo L.) (91)، گندم(Triticum aestivum L.)  (152)، بادام زمینی وحشی (Arachis duranensis K & G)  (109) و در تعدادی از گیاهان آبزی مانند  (Monochoria vaginalis B.)(151) به کار برده شد. با استفاده از این روش، تعیین آلل­های مختلف ژن­های هدف و کاهش تعداد نمونه­هایی که باید تعیین فنوتیپ گردند، امکان­پذیر می­شود. معمول­ترین شکل تنوع ژنتیکی SNP است، به خصوص آلل­های نادری که فراوانی آن­ها کمتر از 5% است نقش مهمی در فنوتیپ ایفاء می­نمایند. اثرات بسیار مؤثر آلل­های نادر روی صفات کمّی و بیماری­های پیچیده در تحقیقات زیادی گزارش شده است (14 و 114). برخی از SNP ها از طریق تغییر توالی آمینو اسید یا ناقص کردن پروتئین­ها عملکرد ژن را تغییر می­دهند (109).   

هدف از این تحقیق، تعیین تنوع آللی ژن­های کاندیدای تحمل به تنش شوری در ارقام و ژنوتیپ­های جو، جستجوی آلل­های جدید، آنالیز روابط فیلوژنی میان ژنوتیپ­های مورد مطالعه، و طبقه­بندی ژنوتیپ­ها در قالب گروه­های هاپلوتیپی بوده است. بدین منظور، از تکنیک اکوتیلینگ به کمک توالی یابی[1] که یک تکنیک مدرن و بسیار کارآ می­باشد برای یافتن انواع پلی­مورفیسم­های نوکلئوتیدی در دو ژن CBL4 و HvHKT1 (ژن­های کنترل کننده تنش شوری) در ارقام مورد مطالعه جو در این تحقیق استفاده گردیده است. این دو ژن در کنترل شوری نقش بسیار مهم و اساسی دارند. در مطالعه حاضر، از تنوع نوکلئوتیدی این ژن­ها در ارقام و ژنوتیپ­های متعلق به مناطق مختلف شور در دنیا برای یافتن منابع جدید و بالقوه تحمل به تنش شوری استفاده شده است. ضرورت انجام چنین تحقیقی این بوده است که علی­رغم تحقیقات فراوان در زمینه اصلاحات ژنتیکی و وجود مکانیسم­های سازگاری، بسیاری از گیاهان با مشکل کاهش عملکرد مواجه می­باشند. یکی از عوامل اصلی کاهش عملکرد در گیاهان به ویژه گیاهان زراعی، اثرات سوء تنش­های غیر زنده است. از میان تنش­های غیر زنده، تنش شوری یکی از عوامل بسیار مهم کاهش عملکرد و هدر رفتن محصول گیاهی است. لذا، این تحقیق با هدف یافتن منابع بالقوه مقاومت به شوری در ژنوتیپ­های جو اجرا گردیده است.